1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)穆利斯(美)和史密斯(加)

 　　穆利斯

　　K.B.Mullis(1944-)

　　美國(guó)生物化學(xué)家

　　穆利斯目前是美國(guó)加州San Dingo一家公司的成員。他于1983年開(kāi)始研究多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,簡(jiǎn)稱(chēng)PCR)，于1985年提出了該方法。

　　所謂PCR方法，首先，根據(jù)待擴(kuò)DNA片段兩端的核苷酸序列，用化學(xué)合成的方法，合成兩個(gè)不同的寡聚核苷酸，它們分別與DNA的兩條鏈互補(bǔ)桎。將過(guò)量的化學(xué)合成引物與四種脫氧核糖核酸(dNTP)、DNA聚合酶以及含有待擴(kuò)增片段的DNA分子混合，經(jīng)過(guò)高溫變性(使DNA雙鏈解開(kāi))、低溫退火(使引物與模板附著)和中溫延伸(合成新的DNA片斷)三個(gè)階段的多次循環(huán)。由于新合成的DNA鏈也能夠作為模板，可以使模板DNA的信息以幾何級(jí)數(shù)擴(kuò)增。一般經(jīng)過(guò)30-35次擴(kuò)增循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)只需要3-10分鐘，可以得到跔的目的DNA片段，使基因放大了數(shù)萬(wàn)倍。

　　由于PCR法不僅具有高靈敏度，而且易于操作，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，因而盡管PCR還是一種新技術(shù)，但3在許多與生物學(xué)相關(guān)的領(lǐng)域內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用。瑞典后家科學(xué)院評(píng)價(jià)：將PCR方法和DNA序列分析結(jié)合起來(lái)，很可能會(huì)成為研究動(dòng)植物分類(lèi)學(xué)的一種　革新工具。

　　1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

　　史密斯

　　M.Smith(1932-)

　　加拿大生物化學(xué)家

　　M.Smith于1932年出生于英國(guó)，畢業(yè)于英國(guó)曼徹斯特大學(xué)，1956年移居加拿大。現(xiàn)任加拿大溫哥哥華大不列顛哥哥倫比亞大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室主任。1978年發(fā)明了寡聚核苷酸定點(diǎn)誘變技術(shù)。這一方法被用來(lái)在體外對(duì)已知的DNA片斷內(nèi)的核苷酸進(jìn)行轉(zhuǎn)換、增刪的突變。這就改變了以往的對(duì)跗物質(zhì)DNA進(jìn)行誘變時(shí)的盲目性和隨機(jī)性，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)者的設(shè)計(jì)而有目的地得到突變體。

　　應(yīng)用寡糖核苷酸進(jìn)行DNA的定點(diǎn)誘變時(shí)，首先要把含有待突變的DNA片斷克隆到M13噬菌體載體中。M13噬菌體的正鏈可以感染具有性纖毛的細(xì)菌，并在菌體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制后，以出芽的形式形成新的帶有正鏈DNA的噬菌體。而存留在菌體內(nèi)的則是雙鏈狀態(tài)的復(fù)制型M13，受M13噬菌體感染的細(xì)菌生長(zhǎng)速度減慢，在細(xì)菌培養(yǎng)皿上會(huì)形成較透明的噬菌斑。

　　將目的DNA插入到復(fù)制型M13的多克隆位點(diǎn)上，去轉(zhuǎn)染細(xì)菌，提取單鏈DNA作為突變的模板。根據(jù)需要市內(nèi)電話(huà)合成帶有突變核苷酸序列的寡聚核苷酸引物，使之與帶有目的DNA的單鏈M13模板雜交，然后加入DNA聚合酶和四種脫氧核糖核苷酸，使雜交上的突變引物延伸，并用DNA連接　酶使新合成的DNA成環(huán)，再去轉(zhuǎn)染細(xì)菌。可用DNA序列分析方法從得到的噬菌體中篩選出帶有突變DNA相應(yīng)的區(qū)段　，從而得到完整的DNA突變體。

　　利用寡聚核苷酸定點(diǎn)誘變技術(shù)，可以人為地通過(guò)基因的改變來(lái)修飾、改造某一已知的蛋白質(zhì)，從而可以研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其與功能的關(guān)系、蛋白質(zhì)分子之間的相互作用。目前，利用寡聚核定點(diǎn)誘變來(lái)進(jìn)行酶及其它一些蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、專(zhuān)一性和活性的研究，已經(jīng)有很多實(shí)例。例如，對(duì)胰蛋白酶的功能的基團(tuán)的研究、高效溶栓蛋白類(lèi)藥物的研制、白細(xì)胞介素-2結(jié)構(gòu)與功能的分析等等。可見(jiàn)，它為酶的工業(yè)化以及臨床應(yīng)用開(kāi)辟了新途徑。因此，作為分子生物學(xué)中的一個(gè)熱門(mén)領(lǐng)域的蛋白質(zhì)工程，其研究方法和途徑都離不開(kāi)寡聚核苷酸定點(diǎn)誘變方法。